共识的形成过程

• 发起组织
  • 中国老年医学学会检验医学专科分会
  • 上海市医学会检验医学专科分会
  • 上海市微生物学会临床微生物学专业委员会
• 编写组构成
  • 国内 hvKP 研究领域 10 余位专家
• 文献检索
  • 关键词：“高毒力肺炎克雷伯菌”等中英文关键词
  • 数据库：PubMed、EMBase 等中外数据库
  • 资料类型：相关文献、研究方案、技术标准、感染控制及生物安全标准等
• 形成流程
  • 拟订关键问题和提纲
  • 起草专家多轮讨论修订形成草案
  • 专家函审，收集 81 条意见并讨论确认
• 适用范围
  • 临床微生物实验室
• 目的
  • 规范 hvKP 检测方法与流程
  • 提供可靠检测结果与报告解读

hvKP 流行病学

• 特点
  • 高侵袭性和高致病性
  • 引发肝脓肿等侵袭性感染
• 流行情况
  • 首次分离：1986 年在化脓性肝脓肿患者体内分离出
  • 流行地区：主要集中在亚洲，包括中国、越南和韩国等
  • 定植情况：健康人群定植率＞10％
  • 感染情况
    • 世界范围内报告增多，细菌性肝脓肿中检出率 40％ - 80％
    • 我国检出率逐年上升，地域有差异，武汉最高 73.9％，浙江最低 8.3％
    • 我国院内侵袭性感染分离菌中 hvKP 达 22.8％
    • 亚洲其他国家感染率较高，欧美相对较低

hvKP 病原学

• 来源与感染部位
  • 大多分离自社区获得性感染患者
  • 引起肝脓肿、肺炎及脑膜炎等多部位侵袭性感染
• 毒力因子
  • 荚膜（K 抗原）
    • 高黏液性与荚膜相关，抵抗吞噬
    • 血清型：K1 和 K2 是主要型别，还有 K5 等其他型别
    • 相关基因：rmpA、rmpA2 和 magA 调节黏液表型
  • 脂多糖（O 抗原）
    • 组成：脂质 A、核心寡糖和可变 O - 抗原多糖侧链
    • 血清型：01 型与肝脓肿的 hvKP 关系密切
    • 相关基因：uge 基因和 wabG 基因增强毒性
  • 菌毛
    • I 型菌毛：由 fim 基因簇编码，FimH 黏附上皮细胞，与泌尿系感染有关
    • III 型菌毛：由 mrkABCDF 编码，在生物膜形成中作用强，与留置管感染有关
  • 铁载体
    • 种类：沙门菌素、气杆菌素、肠杆菌素和耶尔森菌素
    • 编码基因及作用：各有编码基因，增强毒力机制不同
    • 高检出率基因：iroB 和 iucA
  • 其他毒力因子
    • 转运蛋白 PEG - 344 等：peg - 344 等基因编码，检测效能高
• 分子分型
  • 荚膜血清型：根据 K 抗原分型
  • 多位点序列分型（MLST）
    • 常用分子生物学方法
    • 常见分型：欧美 ST258，亚太 ST11，hvKP 以 ST23、ST86 和 ST65 为主
• 耐药性
  • 耐药现状
    • 出现 MDR、XDR、PDR 菌株，治疗困难
    • 我国分离株中 12.6％产 ESBL，ST11 型 CRKP 中高毒力株检出率约 30％
  • 耐药机制
    • 头孢菌素类：产生 SHV - 12、CTX - M 等 ESBL
    • 碳青霉烯类：产生碳青霉烯酶，或产 ESBL 等与孔蛋白突变组合
    • 多黏菌素、替加环素和头孢他啶 - 阿维巴坦：质粒携带耐药基因

hvKP 实验室检测

• 分离培养
  • 样本采集、运送及注意事项
    • 申请单：高度怀疑感染症状患者开具相关申请单，备注临床信息
    • 样本种类：采集病灶脓液、穿刺液等，院感筛查采肛拭子或粪便
    • 采集时间：病程早期或急性期，抗菌药物使用前
    • 送检要求：参考行业标准，尽快送检
  • 常规镜检和分离培养
    • 镜检：革兰阴性杆菌，可见荚膜
    • 培养：临床样本分区划线接种培养，观察菌落形态
    • 血培养：按专家共识流程操作
• 鉴定
  • 生化表型鉴定
    • 生化特征：三糖铁产酸等，产酸克雷伯菌与肺炎克雷伯菌吲哚有别
    • 鉴定方法：采用商品化微生物分类鉴定系统
  • hvKP 确认
    • 金标准：动物实验
    • 常用方法
      • 拉丝试验：菌落拉丝长度≥5mm 为阳性，不能确诊
      • 荚膜分型
        • 免疫学方法：传统血清学分型，有血清交叉反应
        • 分子生物学方法：wzi 分型，快速简便
      • 铁载体检测
        • 定性分析：培养基菌落周围形成金黄色区域表明产生铁载体
        • 定量分析：绘制标准曲线计算含量，≥0.03g／L 强烈预测为 hvKP
• 毒力表型检测
  • 体外试验
    • 人中性粒细胞杀菌活性试验
    • 血清抗性实验
  • 动物实验
    • 大蜡螟
    • 小鼠
    • 斑马鱼
• 特异性基因序列确认
  • 相关毒力基因检测
    • peg344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2
    • PCR方法
      • 普通PCR
      • 多重PCR
  • 二代测序（NGS）
    • 全基因组检测
    • 识别毒力质粒和K基因座
  • 质谱鉴定
    • MALDI - TOF MS
    • 区分K1型hvKP
• 体外药物敏感性试验
  • 耐药表型检测方法
    • 纸片扩散法（K - B法）
    • 肉汤宏量稀释法
    • 肉汤微量稀释法
    • 琼脂稀释法
    • E - test法
    • 自动化药敏系统
  • 抗菌药物选择和结果判定
    • 参照CLSI标准
• 检测流程
  • 分离培养
    • 直接镜检
    • 普通培养
  • 鉴定
    • 生化表型
    • 常规质谱
    • 自动微生物鉴定系统
    • NGS
  • 毒力检测
    • 拉丝试验
    • 荚膜分型
    • 铁载体检测
    • 人中性粒细胞杀菌活性试验
    • 血清抗性实验
    • 动物实验
    • 毒力基因扩增
    • 质谱LDT
  • 药敏试验
    • 微量肉汤稀释法
    • 琼脂稀释法
    • 自动化药敏系统
    • E - test
    • 纸片扩散法（K - B法）

结果报告

• 细菌种属鉴定结果
• hvKP毒力表型结果
• hvKP毒力因子基因型结果
• 体外药敏试验结果

生物安全

• 病原微生物风险分类
  • 第三类，危害级别为三级
  • BSL - 2实验室，二级生物安全防护
• 安全设备
  • 生物安全柜
  • 防护性外衣
  • 面部保护措施
  • 一次性乳胶手套
• 实验活动中生物危害的预防措施
  • 与其他细菌相同防护措施

总结

• hvKP现状
  • 检出率增多，耐药性严重
  • 致病性显著提升
• 建议
  • 增开常态化检测项目
  • 与临床医师沟通，综合分析